摘要利用丹磺酰氯為衍生試劑，1，7-二氨基庚胺做為內(nèi)標(biāo)驗(yàn)證了《GB/T5009． 208 －2008》，以普通黃豆為原料，研究一定條件下細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮和生物胺的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的豆豉中生物胺有 8 種，分別為: 組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺、精胺。發(fā)酵 72 h 后 8 種生物胺中，酪胺含量達(dá)到 488 mg/kg，且從發(fā)酵 48 h 起，豆豉中酪胺的含量與氨基酸態(tài)氮的含量都存在著先大幅增加再緩慢下降的趨勢。對照查閱國家相關(guān)規(guī)定，發(fā)現(xiàn)豆豉中主要具有毒性作用的組胺和酪胺沒有過國家允許范圍，因此理論上不存在危害生理健康的毒性。但應(yīng)注意的是，由于組胺含量處于上升趨勢，細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中要控制發(fā)酵時(shí)間，不然可能會(huì)因?yàn)榻M胺生成造成安全隱患。
豆豉是經(jīng)微生物發(fā)酵制成的調(diào)味副食品，以香誘人、風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者的真愛。根據(jù)制曲發(fā)時(shí)參與的微生物種類可分為毛霉型、曲霉型、細(xì)菌型及脈胞菌型豆豉。水豆豉主要是云、貴、山東一帶民間制作的家常豉，其微生物主要是枯草桿菌以及少量的微球菌乳酸菌，其工藝簡單，就是將黃豆蒸熟后直接裝在袋子或者攤放在稻草上自然發(fā)酵，發(fā)酵完成后直接拌食。水豆豉自然發(fā)酵過程中微生物以細(xì)菌為主，發(fā)酵過程中易產(chǎn)生生物胺。生物胺是一類含氮低分子質(zhì)量化合物的總稱，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪族( 腐胺、尸胺、精胺、亞精胺) 、芳香族( 酪胺、苯基乙胺) 和雜環(huán)類( 組胺、色胺)。人體內(nèi)積累較高數(shù)量的生物胺時(shí)就會(huì)產(chǎn)生毒性作用，其中生物胺中毒性的是組胺和酪胺。
發(fā)酵食品中過量的生物胺會(huì)對機(jī)體健康造成不良的影響。YONGMEIL 等檢測了中國豆醬中的生物胺含量，豆醬中主要含有酪胺、組胺和亞精胺，不同發(fā)酵類型品種生物胺有差別，生物胺生成量與樣品中氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)正相關(guān)，由此可以看出，可利用的游離氨基酸是微生物代謝產(chǎn)生生物胺的必要條件之一。張建華等檢測了納豆發(fā)酵過程中的生物胺，在發(fā)酵納豆樣品中檢測到亞精胺、精胺、腐胺、酪胺 4 種生物胺，其中亞精胺的含量占總生物胺的70% 左右，與人體有直接毒性的生物胺—酪胺含量低于 14 mg/kg，95% 以上的生物胺都是對人體沒有直接毒性的多聚胺。TANG T 等檢測了腐乳中生物胺的含量，同時(shí)比較了微生物發(fā)酵腐乳與酶制腐乳中生物胺含量的差別。腐乳中主要含有色胺、腐胺、組胺和酪胺，其平含量分別為 39. 0、34. 6、18. 2、21. 7mg / kg，β-苯乙胺、亞精胺和精胺含量較低。微生物發(fā)酵腐乳中生物胺總量( 129. 0 mg/kg) 低于酶制腐乳( 137. 7 mg/kg) ，腐乳中生物胺總量低于安全限量。
目前國內(nèi)外對于毛霉型、曲霉型豆豉和以納豆為代表的細(xì)菌型豆豉的營養(yǎng)成分和發(fā)酵工藝都進(jìn)行了較深入的研究，但國內(nèi)對自然發(fā)酵過程中生物胺的變化研究甚少。且目前國際上對食品中的生物胺沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，少數(shù)國家也只對于食品中的部分生物胺作出了含量限定，現(xiàn)有的各項(xiàng)法規(guī)都只對魚類及其制品中的組胺進(jìn)行了限定，因此對于食品中生物胺毒性和檢測技術(shù)的基礎(chǔ)研究，和生物胺限量標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確評估工作都是具有實(shí)際意義的。農(nóng)村中，許多農(nóng)戶都是將黃豆在自然條件下發(fā)酵，直接拌料進(jìn)行食用，本文以普通黃豆為原料，研究一定溫度、一定裝載量、不同發(fā)酵時(shí)間對細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中生物胺及氨基酸態(tài)氮 2 個(gè)指標(biāo)的影響及其相關(guān)性，為食品安全提供參考。
1 材料與方法
1. 1 原料與試劑
1. 1. 1 原料
黃豆、生姜、大蒜、桂皮、八角。
1. 1. 2 試劑
NaOH，鄰苯二甲酸氫鉀，甲醛，組胺鹽酸鹽 ( himstaminedihydrochlo-ride) 、β-苯乙胺 ( β-phenylethylamine ) 、酪胺鹽酸鹽( tyramine hydrochloride) 、腐胺( putrescine) 、尸胺( ca-daverine) 、5-羥色胺( serotonin) 、精胺( spermidine) 、亞精胺( spermine) 、色胺鹽酸鹽( tryptaminehydmchlo-ride) ， l，7 二氨基庚烷( 1，7-diaminohep-tane，內(nèi)標(biāo)) ，苯甲胺鹽酸鹽 ( benzylaminehydrochloride，內(nèi)標(biāo)) 、丹磺酰氯 ( dansylchloride) ，甲醇、丙酮，色譜純; 乙醚( 重蒸) 、正丁醇、氯仿、HCl、三氯乙酸( TCA) 、NaCl、NaHCO3、谷氨酸鈉( 分析純) 、純水。
1. 2 主要儀器設(shè)備
TE212-L 電子天平; HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋;pHS-25 型數(shù)顯酸度計(jì); HJ-1磁力加熱攪拌器; DGG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱; 立式實(shí)驗(yàn)型膠體磨; 高效液相色譜儀 HPLC 配紫外檢測器或二管陣列檢測器; 離心機(jī)( 4 000 r/min); 旋渦混合器 ortex-2genie USA; 氮?dú)鉂饪s器( N-EVAPOＲATOＲ) ; Waters 高效液相色譜儀 e2695 配2489 紫外檢測器; 色譜柱 C18柱( 250 mm ×4. 6 mm，5 μm); 純水器B110-B; 微型旋渦混合儀 WH-2; 臺(tái)式低速離心機(jī) TG16; 多用調(diào)速振蕩器 HY-4; 氮?dú)獯祾邇xMD200; 電子分析天平AＲ2140; 生化培養(yǎng)箱 LＲH-300。
1. 3 實(shí)驗(yàn)方法
1. 3. 1 細(xì)菌型水豆豉制作工藝流程
黃豆→清選→加水浸泡→蒸煮( 高壓 121 ℃、15min) →冷卻→前發(fā)酵( 37 ℃ 、不同時(shí)間) →直接拌料→成品。
1. 3. 2 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)
以下操作為的黃豆浸泡條件: 泡豆水 pH8. 0，泡豆溫度常溫，豆量∶ 水量為1∶ 4( g∶ mL) ，泡豆時(shí)間 10 h。高壓 121 ℃、15 min 蒸熟，降溫到 45℃ 后，用 1 kg 的食品級(jí)包裝袋包裝發(fā)酵，平整后在包裝袋表面扎數(shù)個(gè)小孔，裝豆量800 g，發(fā)酵時(shí)間 72 ～120 h，發(fā)酵溫度為 37 ℃，稱取發(fā)酵樣品，按48、72、96、120 h不同發(fā)酵時(shí)間，測定氨基酸態(tài)氮和生物胺含量，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù) 3 次。
1. 4 檢測方法
1. 4. 1 氨基酸態(tài)氮的測定
1. 4. 2 生物胺含量的測定
1. 4. 2. 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品用 0. 1 mol/L HCl 溶液配制成質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 的儲(chǔ)備液( 酪胺鹽酸鹽和二鹽酸組胺需折算掉鹽酸鹽) ，分別吸取相同體積的 8 種生物胺單組分置于同一個(gè)容量瓶中，配制成 100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。溶液避光保存于4 ℃ 冰箱中。
將混合使用液配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度為: 2. 50，5. 00，10. 00，15. 00，25. 00，50. 00 mg / L。分別吸取 0. 5 mL 生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行生物胺衍生化。為確定生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序，配制成 40 mg/L 的 8 種單一生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，可由生物胺標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的保留時(shí)間來確定每種生物胺。
1. 4. 2. 2 生物胺的提取和衍生生物胺的提取和衍生依據(jù)《GB/T 5009. 208 －2008 食品中生物胺含量的測定》
準(zhǔn)確稱取絞碎后的豆豉樣品 10. 00 g，置 100 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 5% 三氯乙酸溶液，和 2. 0 mL( 100 mg / L) 內(nèi)標(biāo)使用液，混勻，振蕩提取 60 min，轉(zhuǎn)至 50 mL 離心管中，3 600 r/min 離心 10 min，取上清液，置 50 mL 容量瓶中，連續(xù)提取 2 次，合并上清液，用 5% 三氯乙酸稀釋至刻度，濾紙過濾。
將上述溶液加入適量 HaCl 至飽和，準(zhǔn)確移取該飽和液 5. 00 mL，置于 15 mL 離心管中，用 0. 1 mol/L的 NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 至 12. 0，加入 5. 0 mL 正丁醇-三氯甲烷混合液( 1 +1) ，渦旋振蕩5 min，3 600 r/min離心10 min，取上層有機(jī)相，再重復(fù)萃取 2 次，后一步萃取用分液漏斗分離，合并萃取液，混勻，取3. 0 mL萃取液并加入 0. 2 mL 1 mol / L HCl，混合后40℃ 水浴下氮?dú)獯蹈�，加�?1. 0 mL 1mol / L HCl 使殘留物溶解，待衍生。
取經(jīng)過提取，凈化、萃取后的樣液 0. 5 mL，置于10 mL 具塞試管中，加入 1. 5 mL NaHCO3飽和溶液、1. 0 m 丹磺酰氯衍生溶液，振蕩使混勻。置 60 ℃ 培養(yǎng)箱中反應(yīng) 30 min，中間振蕩 2 次，取出，分別加入100 μL 谷氨酸鈉( 50 mg / mL 飽和 NaHCO3溶液) ，振蕩混勻，60 ℃中保溫 15 min。取出，每個(gè)試管中加入1 mL 純水，40 ℃ 水浴下用氮?dú)獬鋈ケ�。加�? mL乙醚，振蕩 2 min，靜置分層后吸取出上層有機(jī)相( 乙醚層) ，重復(fù)萃取 2 次，合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈�，加�?1. 0 mL 甲醇使殘留物溶解，振蕩混勻，0. 22 μm 濾膜針頭濾器過濾，濾液待測。
樣品衍生后，依據(jù)《GB/T 5009. 208 － 2008 食品中生物胺含量的測定》上機(jī)測定。為了使各種生物胺的保留時(shí)間縮短，而響應(yīng)值高，分離度高，改變了色譜條件: 將 1. 5 mL/min 流速改為 1. 0 mL/min。
1. 4. 2. 3 精密度的測定
取濃度為 25. 00 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生樣品，平行進(jìn)樣 7 次，根據(jù)測定結(jié)果計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差ＲSD。
1. 4. 3 對照樣品分析
樣品來源: 購買 3 個(gè)不同品牌商品發(fā)酵豆豉測定其中 8 種生物胺的含量。生物胺的提取: 樣品經(jīng)研磨充分后，取樣，用三氯乙酸提取，將試樣除脂肪、萃取進(jìn)行凈化，然后進(jìn)行生物胺的衍生反應(yīng)，樣液待測。
1. 4. 4 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)利用 Excel 表格進(jìn)行分析。
2 結(jié)果與分析
2. 1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際樣品圖譜
相較國標(biāo)方法 30min 生物胺衍生物洗脫出來，整個(gè)梯度洗脫結(jié)束為45 min，更改流速和調(diào)整洗脫程序后 28 min 內(nèi)生物胺衍生物被洗脫出來，洗脫程序結(jié)束時(shí)間為32 min，提前了 13 min，節(jié)省了樣品分析時(shí)間，在實(shí)際檢驗(yàn)分析工作中有很重要的意義，且各生物胺衍生物分離效果好，峰形對稱，無雜質(zhì)干擾，因此該流動(dòng)相梯度是可行的。8 種單一生物胺衍生物分析結(jié)束后，確定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 8 種生物胺衍生物的出峰順序?yàn)? 組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺、精胺。
2. 2 實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證
8 種生物胺的含量在 2. 5 ～ 50 mg / L 時(shí)，其回歸方程Ｒ2大于等于 0. 992 8 ，可以滿足生物胺檢測的需求。
2. 3 精密度
2. 4 前發(fā)酵過程中生物胺的變化
選取不同時(shí)間梯度對豆豉中生物胺含量的測定結(jié)果，從發(fā)酵豆豉中共檢測到8 種生物胺。樣品中含有 β-苯乙胺含量、尸胺、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺。不同樣品中生物胺種類及總量有差異。發(fā)酵水豆豉中生物胺含量的顯著差異與原料裝載量、發(fā)酵或儲(chǔ)存時(shí)間有關(guān)。提取上表中酪胺、尸胺、組胺的數(shù)據(jù)繪制成折線圖，與不同發(fā)酵時(shí)間氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行比對。從發(fā)酵 48h 起，豆豉中氨基酸態(tài)氮含量存在著先大幅增加再緩慢下降的趨勢，由于是自然發(fā)酵，所以隨著時(shí)間延長細(xì)菌繁殖，可能有脫羧酶的微生物參加，而導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮出現(xiàn)后期下降的現(xiàn)象。
豆豉中酪胺的含量與氨基酸態(tài)氮的含量變化存在著性，這也從一定程度上反映了和驗(yàn)證了之前關(guān)于氨基酸態(tài)氮是生物胺產(chǎn)生的條件之一的說法。發(fā)酵初期豆豉中的游離氨基酸含量越高，產(chǎn)生生物胺的可能性就越大。而尸胺含量在發(fā)酵 72 h 隨著氨基酸態(tài)氮含量的增加達(dá)到值，之后驟降到相對穩(wěn)定的較低值。組胺含量從發(fā)酵 48 h 起逐漸上升，雖然沒有在含量上明顯表現(xiàn)出和氨基酸態(tài)氮的性，但是其含量的上升可能消耗了游離氨基酸而導(dǎo)致了氨基酸態(tài)氮后期的緩慢下降，因此細(xì)菌性豆豉自然發(fā)酵過程中要控制發(fā)酵時(shí)間，不然可能會(huì)因?yàn)榻M胺生成造成安全隱患。
2. 5 對照材料中生物胺的含量
所測定樣品中未檢出精胺和亞精胺。臘八豆含有 4 種生物胺，但是含量較低;豆鼓的生物胺含量較低，種類少，油辣椒豆豉生物胺含量，僅含有少量的色胺。色胺能夠引起高血壓，然而許多國家都沒有對色胺制定限量標(biāo)準(zhǔn)。
與自然發(fā)酵細(xì)菌性豆豉工藝比較，豆豉、臘八豆一般采用接種米曲霉或者毛霉發(fā)酵，加上有油炸或炒制工藝和其他配料，這類產(chǎn)品中生物胺的含量較低。
來源：惠合膠體磨研磨設(shè)備廠

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1 種細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中生物胺的變化