摘要:比較了一級蒸餾和二級蒸餾竹醋液的抑菌效果以及其自由基清除能力、總酚和總黃酮的含量，并通過高效液相色譜對相關(guān)活性組分含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明: 一級蒸餾和二級蒸餾竹醋液對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠酵母、黑曲霉均表現(xiàn)出較好的抑制效果和較強(qiáng)的抗氧化能力，但二級蒸餾會顯著降低竹醋液的抑菌能力及抗氧化能力。此外，高效液相色譜檢測結(jié)果表明，二級蒸餾后竹醋液在 254 nm 和 270 nm 波長下吸收峰的數(shù)量和峰面積均顯著降低。竹醋是竹炭生產(chǎn)的副產(chǎn)物，即竹材經(jīng)炭化、熱解產(chǎn)生的具特殊焦煙氣味的黃色或紅褐色液體。竹醋具有去異味、殺菌、除蟲、抗病毒、促進(jìn)植物生長、防止血糖降低等作用，因此作為一種綠色、天然、環(huán)保的新資源，竹醋在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、化工食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。研究表明，竹醋可以延緩草魚肉塊腐敗變質(zhì)，延長其貨架期。竹醋與殼聚糖復(fù)配用于圣女果保鮮，既可延長保藏時間，又不損害果實(shí)的外觀及品質(zhì)。竹醋的超氧陰離子、二苯代苦味�；杂苫�( DPPH·) 清除能力與茶多酚相近，但竹醋液具有的特殊焦煙氣味可能會影響食品的風(fēng)味，從而限制其在食品保鮮中的應(yīng)用。因此，需要對竹醋液通過二級蒸餾進(jìn)行精制，精制后的竹醋液較原液更加透明，煙熏酸味變淡。然而，二級蒸餾后對竹醋液的抑菌能力、抗氧化能力及功效組成成分含量的影響還鮮有報道。因此，本研究考察并比較了竹醋一級蒸餾和二級蒸餾液的抑菌性能、抗氧化性及代謝指紋圖譜，以期為將精制竹醋液開發(fā)成抑菌、殺菌、防腐劑等產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)材料
1. 1. 1 樣品
竹醋液由江陰中炬生物科技有限公司提供，制作純化采用江陰中炬生物科技有限公司 2010－1 型竹木醋提取提純設(shè)備。竹醋液制備工藝為竹材破碎后制成竹片，然后將其干餾和炭化，進(jìn)行兩級冷凝，并將兩級冷凝所得的竹醋液在混合罐中混合后靜置。將 pH 值為2. 5 ～3. 0 的竹醋液置于 40 ～100 ℃、真空度 0. 080 MPa 以上的條件下進(jìn)行一級蒸餾，至餾出體積為原液體積的 80% ～90% 時即可，所得到的餾出液，進(jìn)行冷凝歸集。將一級蒸餾液置于40 ～100 ℃ 、真空度 0. 085 MPa 以上的條件下進(jìn)行二級蒸餾，至餾出體積為原有體積的 80% ～90% 時即為二級蒸餾液。
1. 1. 2 試劑
三吡啶三吖嗪( TPTZ) 、2，2'-聯(lián)氮－雙-( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) ( ABTS) 、二苯代苦味�；�( DP-PH) 等均購于 Sigma-Aldrich 公司。色譜純的甲醇和乙酸購自 Fisher 公司，其他試劑均為分析純。
1. 1. 3 菌株
大腸桿菌 ( Escherichia coli) 、銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 、金黃色葡萄球菌( Staphy-lococcus aureus) 、白色念珠酵母 ( Canidia albicans) 、黑曲霉( Aspergillus niger) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
1. 1. 4 培養(yǎng)基
PDA 培養(yǎng)基: 馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 18g，加水補(bǔ)足 1 L，121 ℃ 滅菌 15 min。 LB 培養(yǎng)基: 胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂18 g，加水補(bǔ)足1 L，用 NaOH 調(diào) pH 值至7. 0 ～7. 2，121 ℃滅菌15min。 YPD 培養(yǎng)基: 酵母浸粉 10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g，瓊脂18 g，加水補(bǔ)足 1 L，121 ℃滅菌15 min。
1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器
DH 500 AB 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司; SHH－50L 型生化培養(yǎng)箱，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司; MJX－250Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱，廣州省醫(yī)療器械廠; T6 型新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司; QL－901 型振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司; CL200+型筆式余氯/pH/OＲP 計，上海三信儀表廠; ES －300A 型電子天平，長沙湘平科技發(fā)展有限公司，1100 型高效液相色譜儀( high performance liquid chromatography，HPLC) ，安捷倫公司; UV2450 型分光光度計，Shi-madzu 公司。
1. 3 測定方法
1. 3. 1 濾紙片擴(kuò)散法測定抑菌作用
取竹醋液于超凈工作臺中用無菌水配成體積分?jǐn)?shù)為 70%，50%，30%，20%，10% 的稀釋液。取 50μL 菌懸液( 細(xì)菌濃度為 1 × 106個/mL，真菌為 1 ×105個/mL) 鋪板，將濾紙片放至平板中央，加 30 μL樣品，以水作對照。適溫培養(yǎng)( 細(xì)菌 37 ℃培養(yǎng)，霉菌25 ℃ 培養(yǎng)，酵母 28 ℃ 培養(yǎng)) ，待對照長滿后，測量抑菌圈直徑。
1. 3. 2 比濁法測定殺菌作用
每支試管加入2. 5 mL 配置好的樣品－培養(yǎng)基混合物，然后再加入 0. 5 mL 菌懸液，菌懸液濃度分別為: 細(xì)菌1 ×107個/mL; 白色念珠酵母1 ×107個/mL; 黑曲霉 600 nm 下的透光度 T =75% ( ±2%) 。充分震蕩后，搖床培養(yǎng)，細(xì)菌 37 ℃、150 r/min，黑曲霉的培養(yǎng)條件為 25 ℃、150 r/min，酵母的培養(yǎng)條件為 28℃ 、150 r / min。培養(yǎng) 24 h。取 50 μL 菌液涂板。 E。 co-li、S。 aureus 于 37 ℃ 培養(yǎng)，A。 niger 于 25 ℃ 中培養(yǎng)，酵母于 28 ℃培養(yǎng)。待對照長滿板后，觀察結(jié)果。
1. 3. 3 抗氧化指標(biāo)的測定
測量體系含 0. 2 mL 樣品，3 mL TPTZ 工作液和0. 3 mL 醋酸鹽緩沖液( 0. 3 mol / L，pH = 3. 6) ，37 ℃下放置45 min 后于593 nm 下測其吸光度，樣品總自由基清除能力以每毫升樣品中含有的活性單位來表示( U/mL) 。
清除 DPPH 自由基能力的測定，將對 DPPH 自由基 50% 清除率定義為 1 個活性單位( U) ，清除 DPPH 自由基能力以每克鮮重樣品中含有的活性單位來表示( U·( g·fw)－ 1) 。羥自由基清除能力的測定依據(jù)劉駿的方法。
將對羥自由基 50% 清除率定義為 1 個活性單位( U) ，清除羥自由基清除能力以每毫升樣品中含有的活性單位來表示( U/mL) 。
0. 2 mL 樣品，1. 0 mL 磷酸緩沖液( PBS) ( 0. 2 mol/L，pH 值為6. 6) 和 1. 0 mL 1% 鐵氰化鉀混合均勻，于 50 ℃ 水浴鍋中放置 20 min，取出后立即冷卻，體系降溫后加入1. 0 mL 10% 三氯乙酸 ( TCA) ，充分混勻后取出 1mL，再加入 2 mL 蒸餾水和 0. 3 mL 0. 1% FeCl3，放置10 min 后于 700 nm 下測其吸光度。超氧陰離子能力的測定采用氮藍(lán)四唑光照法。將對超氧陰離子 50% 清除率定義為 1 個活性單位( U) ，清除超氧陰離子自由基清除能力以每毫升樣品中含有的活性單位來表示( U/mL) 。
1. 3. 4 總酚和總黃酮的測定
以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總酚含量換算為每毫升樣品中沒食子酸的含量( μg/mL) 。
以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中總黃酮含量換算為每毫升樣品中蘆丁的含量( μg/mL) 。
1. 3. 5 竹醋的 HPLC 指紋圖譜分析
竹醋樣品采用 HPLC，選用 254，270 nm 波長進(jìn)行分析。色譜條件: ODS-3 ( 250 mm × 4. 6 mm，5μm) 色譜柱; 流動相為 1% 乙酸水溶液( B) －甲醇( C) ; 梯度洗脫為流速 1 mL/min; 進(jìn)樣量 10 μL;二極管陣列檢測器( DAD) ，設(shè)定波長 254 nm 和 270nm 。

2 結(jié)果與分析
2. 1 二級蒸餾對竹醋液抑菌效果的影響
竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液的抑菌效果的比較。竹醋液對 E。 coli、P。 aeruginosa、S。 aureus、C。 albicans、A。 niger 均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，且其中一級蒸餾液的抑菌效果均優(yōu)于二級蒸餾液。與一級蒸餾液相比，二級蒸餾液對 E。 coli、P。 aeruginosa、S。 aureus、C。 albicans、A。niger 的抑菌圈直徑分別減小了 31. 48% ，15. 38% ，34. 78% ，47. 62% ，50. 85% ，表明將竹醋液二級蒸餾可降低其抑菌效果。
2. 2 二級蒸餾對竹醋液殺菌效果的影響
比較了竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液對 5種指示菌的致死濃度。結(jié)果表明，兩種竹醋液對液體培養(yǎng)的 E。 coli、P。 aeruginosa、S。 aureus、C。 albicans、A。 niger 均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，濃度為 25% 及以上的竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液可完全抑制 5 種受試菌的生長。此外，由竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液再鋪板結(jié)果可知，兩種竹醋液對 E。 coli 及 C。 al-bicans 的最低殺菌濃度均為 5% 。而竹醋一級蒸餾液對 P。 aeruginosa、S。 aureas 及 A。 niger 的最低殺菌濃度均低于二級蒸餾液。可以看出二次蒸餾處理促進(jìn)竹醋的最低殺菌濃度升高。
2. 3 二級蒸餾對竹醋液抗氧化能力的影響
對竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液抗氧化能力進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，與一級蒸餾液相比，竹醋二級蒸餾液的 DPPH 自由基清除能力、總抗氧化能力、超氧陰離子清除能力、總還原能力分別下降了64. 48% ，94. 66% ，59. 92% ，90. 46% 。而竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液的羥自由基清除能力并無明顯差異。
2. 4 二級蒸餾對竹醋液總酚、總黃酮含量的影響
對竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液中總酚，總黃酮含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，竹醋一級蒸餾液中的總酚、總黃酮質(zhì)量濃度分別為 60. 23 μg/mL和 93. 59 μg/mL，而二級蒸餾液中的總酚、總黃酮質(zhì)量濃度僅為 21. 91 μg/mL 和 4. 41 μg/mL，分別減少了 63. 62%和 95. 29%。
2. 5 二級蒸餾對竹醋液功效成分的影響
取竹醋一級蒸餾液和二級蒸餾液樣品分別進(jìn)行HPLC 指紋圖譜分析，測定兩種樣品在 254 nm 和270 nm 波長下的吸收峰。結(jié)果表明，竹醋一級蒸餾液樣品在 254 nm 波長下通過分析獲得22 個吸收峰，在 270 nm 波長下得到 27 個吸收峰。
而竹醋二級蒸餾液樣品在 254 nm 下僅獲得 1#、4#、7#、9#和 13#5 個吸收峰，這 5 個峰峰面積分別為875. 7，393. 8，64. 0，46. 7，34. 0 mAU·s，均顯著低于一級蒸餾液吸收峰面積。此外竹醋二級蒸餾液樣品在 270 nm 下僅獲得 1#、6#、11#、12#和 15#5 個吸收峰，峰面積分別為 182. 1，1 048. 7，130. 9，26. 7，77. 4 mAU·s，與竹醋一級蒸餾液相比，二級蒸餾液峰面積值分別降低了 63. 52% ，29. 79% ，75. 61% ，92. 74% ，86. 46% 。以上結(jié)果表明，二級蒸餾過程將造成竹醋液中酚類及黃酮類等功效活性成分的損失。

來源：惠合膠體磨研磨設(shè)備廠

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二級蒸餾對竹醋液抑菌與抗氧化效果的影響