摘要：本文介紹了一種用肝素對尿激酶進(jìn)行化學(xué)修飾的方法，以改善其穩(wěn)定性。經(jīng)肝素修飾的尿激酶對蛋白酶有較強(qiáng)的抗水解能力，對熱及 pH 亦具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。肝素修飾尿激酶比活為 1.25×105u/mg，分子量為 58kDa。該修飾法獲得的尿激酶半衰期明顯延長，可大大提高其臨床療效。
尿激酶（urokinase，簡稱 UK）是一種能使纖維蛋白原活化并生成具有溶解性纖維蛋白能力的纖維蛋白溶解酶，屬絲氨酸蛋白酶類，等電點(diǎn)在 8.4-9.7之間。適用于各種血栓病及心肌梗死等疾病的臨床治療。此外，尿激酶還參與體內(nèi)許多重要的生物學(xué)過程，如排卵、細(xì)胞生長與分化、癌變及炎癥發(fā)生等。
由于尿激酶主要提取自人尿或腎細(xì)胞的組織培養(yǎng)液，因此尿激酶和其他纖維蛋白溶解酶相比具有無抗原性、無熱源、毒副作用小、特異性高和療效確切等多個優(yōu)點(diǎn)。但其在人體內(nèi)的半衰期只有15min，活性不穩(wěn)定。因此，在體外將尿激酶側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生理相容性的大分子基團(tuán)以共價鍵連接，從而增強(qiáng)尿激酶構(gòu)象的穩(wěn)定性、耐熱性、耐酸堿性和抗蛋白酶水解能力，加強(qiáng)其臨床療效是非常必要的。
本文介紹了一種肝素修飾尿激酶的制備方法，并對其耐熱、耐酸堿、抗蛋白酶水解能力等性能進(jìn)行了研究，以期為其應(yīng)用提供參考。

1 材料
1.1 儀器
電子天平 DV215CD；真空冷凍干燥機(jī) LGJ-10；冷凍離心機(jī) Allegra X-15R。
1.2 試劑
尿激酶凍干粉，購自天津應(yīng)用科學(xué)研究所；肝素，購自北京桑普生化試劑公司；蛋白質(zhì) Marker，購自 Sigma 公司；高碘酸鈉、亞硫酸氫鈉、三羥甲基氨基甲烷（生化試劑）、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉均為分析純。

2 方法
2.1 尿激酶的肝素修飾
低分子肝素的活化：稱取肝素 1.0g 溶于 10mL蒸餾水中，加 12%的高碘酸鈉溶液 1mL，調(diào) pH 5.0，4℃下攪拌反應(yīng) 20h，滴加 10%的亞硫酸氫鈉溶液至變色，得活化的低分子肝素溶液。
尿激酶的化學(xué)修飾反應(yīng)：稱取尿激酶 0.5g，溶于0.3mol/L、pH 7.8 的磷酸鹽緩沖液 15mL 中，加活化的低分子肝素溶液 10mL，4℃下電磁攪拌反應(yīng) 24h。反應(yīng)后經(jīng)葡聚糖凝膠 G-100 柱分離，收集活性洗脫液，冷凍干燥，得粉末狀低分子肝素-尿激酶結(jié)合物。
2.2 肝素修飾尿激酶對蛋白酶水解、熱及 pH 穩(wěn)定性分析
2.2.1 抗蛋白酶水解能力
將同一濃度修飾尿激酶和未修飾尿激酶分別加人 l5％胃蛋白酶溶液中。pH 7.8 保溫 37℃，于 0h，2h，4h，6h 分別取樣，測定其活性。
2.2.2 耐熱穩(wěn)定性試驗(yàn)
將修飾尿激酶和未修飾尿激酶分別置于 30℃，40℃，50℃，60℃，70℃ 的恒溫水浴箱中，pH 7.8 保溫 30min 后測定其活性。
2.2.3 耐酸堿性試驗(yàn)
將修飾尿激酶和未修飾尿激酶分別溶于 PH2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 的磷酸鹽緩沖液中，于 37℃恒溫 30min 后檢測其活性。
2.3 尿激酶活性測定
酶活力測定方法參照文獻(xiàn)。

3 結(jié)果與分析
3.1 修飾和未修飾初始酶的活力
經(jīng)高碘酸鈉活化的肝素除 1→3 連接的糖苷鍵外其他類型的糖苷鍵均被高碘酸鈉氧化與水生成不同的醛，從而與尿激酶分子中的 ε-氨基進(jìn)行不同程度的修飾。采用肝素修飾的尿激酶，其活力明顯高于未修飾尿激酶，因此采用低分子量肝素對尿激酶進(jìn)行修飾是可行的。
3.2 抗蛋白酶水解能力
采用肝素修飾后的尿激酶，其抗蛋白酶水解能力明顯增強(qiáng)。蛋白水解酶作用于酶分子某些特定敏感鍵后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鍵斷裂，交聯(lián)于尿激酶上的肝素能產(chǎn)生空間障礙，阻擋蛋白水解酶接近尿激酶，能“遮蓋”尿激酶分子敏感鍵免遭破壞。此外尿激酶分子上許多敏感基團(tuán)，如賴氨酸的ε-氨基等參與修飾反應(yīng)，交聯(lián)上肝素分子后，減少了酶分子遭受蛋白水解酶破壞的可能性。
3.3 耐熱穩(wěn)定性試驗(yàn)
肝素修飾尿激酶的熱穩(wěn)定性顯著高于未修飾尿激酶。尿激酶的化學(xué)修飾是通過將尿激酶與肝素分子中存在的多個活性反應(yīng)基團(tuán)形成多點(diǎn)交聯(lián)，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生"鋼性"，不易伸展打開，同時減小酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動，從而增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性。因此，經(jīng)肝素修飾的尿激酶能適應(yīng)較廣的溫度范圍，熱穩(wěn)定性更強(qiáng)。
3.4 耐酸堿性試驗(yàn)
尿激酶經(jīng)肝素修飾后擴(kuò)大了 pH穩(wěn)定范圍，這是由于修飾酶被“固定”于更活潑狀態(tài)，當(dāng)溶液 pH 下降、上升時，酶仍能保持這種活性狀態(tài)，使其催化功能所受影響較小。
3.5 修飾尿激酶的蛋白電泳檢測
經(jīng)肝素修飾的尿激酶分子量為58KDa，明顯高于未修飾尿激酶。且經(jīng)過葡聚糖凝膠G-100 柱分離純化，條帶單一，可能是由于肝素不適于修飾低分子量的尿激酶，而主要針對高分子量尿激酶進(jìn)行了有效修飾。低分子量肝素修飾尿激酶迄今國內(nèi)外少見報道，該修飾酶具有高活性、穩(wěn)定性強(qiáng)、無毒、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，在體內(nèi)半衰期明顯延長，可大大提高其臨床療效；并可應(yīng)用于該酶的體外實(shí)驗(yàn)，對其臨床應(yīng)用進(jìn)行深入研究。此外，我國自古有喝人尿預(yù)防和治療血栓等疾病的應(yīng)用，肝素修飾的尿激酶具有較強(qiáng)的抗蛋白酶水解能力，對熱及 pH 亦具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，可將此修飾酶開發(fā)為口服制劑預(yù)防心腦血管等疾病，使其具備更廣闊的應(yīng)用前景。

來源：惠合膠體磨研磨設(shè)備廠

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肝素修飾尿激酶的制備方法