摘要：研究了微波處理、水浴加熱、超聲處理及高壓均質(zhì)對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白含量的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明微波處理和水浴加熱對(duì)提高高溫變性豆粕氮溶解指數(shù)效果明顯，并對(duì)兩種加熱處理方式進(jìn)行了正交 L9( 34) 優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，微波( 700 W) 處理在 pH 8. 0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% ，時(shí)間 5 min 時(shí)氮溶解指數(shù)達(dá)到 70. 39% ; 加熱處理高溫變性豆粕的較佳條件為 pH 8. 0，反應(yīng)時(shí)間 90 min，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1 %，其溶液氮溶解指數(shù)可達(dá) 74. 81%; 但在較高底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)( 3%)下，加熱處理高溫變性豆粕的氮溶解指數(shù)只達(dá)到 63. 96%。微波處理后蛋白質(zhì)的其他功能性要優(yōu)于酶處理后的，因此微波加熱處理高溫變性豆粕可有效提高生產(chǎn)效率，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)資源，具有良好的功能特性。功能特性的體現(xiàn)要依賴于蛋白質(zhì)的溶解性，所以，蛋白質(zhì)的溶解性將影響蛋白質(zhì)的功能特性。高溫變性豆粕是大豆制油后的副產(chǎn)物，制油工藝中高溫處理工序造成了蛋白質(zhì)的熱變性，導(dǎo)致了高溫變性豆粕的蛋白質(zhì)溶解度較低。可采用物理、化學(xué)、生物方法等的處理方式，以提高蛋白質(zhì)的溶解性和功能特性，其中物理改性由于較為簡(jiǎn)單安全，因此被廣泛應(yīng)用。 Jambrak 等利用超聲波對(duì)大豆蛋白和乳清蛋白進(jìn)行處理，涂宗財(cái)?shù)�、Iordache 等對(duì)大豆分離蛋白和熱變性乳清蛋白進(jìn)行了高壓均質(zhì)及超高壓射頻均質(zhì)處理，結(jié)果表明蛋白質(zhì)的溶解性均有明顯提高，并且處理后的蛋白質(zhì)發(fā)泡性、乳化性和凝膠性效果均得到了改善。
Arrese 等、Petruccelli 等和 Wagner 等在 20世紀(jì) 90 年代對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行了不同程度的熱處理，熱處理后的大豆分離蛋白仍然具有較高的溶解性。近些年隨著微波加熱技術(shù)的發(fā)展，利用微波技術(shù)輔助加工食品原料成為研究重點(diǎn)。 Tao Yong-zhen 等利用微波加熱技術(shù)處理多糖類(lèi)物質(zhì)，使其溶解性大大提高。但這些技術(shù)應(yīng)用于高溫變性脫脂豆粕的文獻(xiàn)國(guó)內(nèi)未報(bào)道，本研究擬利用超聲波、高壓均質(zhì)、水浴加熱和微波加熱處理方式對(duì)高溫變性豆粕進(jìn)行處理，以期提高高溫變性豆粕的溶解性。
1 材料與方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)材料
高溫變性豆粕，黑龍江省雙鴨山市楊霖油脂廠。
1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
THZ －82 型恒溫水浴振蕩器，金壇市億通電子儀器有限公司;
恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠;
KQ－500B 型容器式超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司;
MM－2270M 型微波爐，青島海爾公司;
JJ －0. 1 /60 型均質(zhì)機(jī)，廊坊市通用機(jī)械有限公司;
飛鴿TDL －40B 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;
PHS －3C型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠;
HYP －2 型消化爐，上海纖檢儀器有限公司;
TDW 馬弗爐: 溫州市雙嶼儀器廠。
化學(xué)試劑為化學(xué)純或分析純; 消泡劑為食品級(jí)。
1. 3 實(shí)驗(yàn)方法
1. 3. 1 測(cè)定方法
蛋白溶解度測(cè)定: 蛋白溶解度 = 上清液蛋白質(zhì)含量/樣品總蛋白含量;
蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考 GB 5009. 5—2003;
粗脂肪測(cè)定參考 GB 5009. 6—2003;
灰分測(cè)定參考 GB 5009. 4—2003；水分測(cè)定參考 GB 5009. 6—2003;
粗纖維測(cè)定參考 GB 5009. 10—2003;
總糖含量測(cè)定參考孫偉偉等的檢測(cè)方法。
1. 3. 2 高溫變性豆粕預(yù)處理
稱(chēng)取粉碎過(guò) 80 目的高溫變性豆粕粉 5 g 到 500mL 三角瓶中，加入 250 mL 蒸餾水，在室溫下 ( 25℃ ) 振蕩搖勻 120 min。
1. 3. 3 超聲波處理
將 1. 3. 2 處理好的高溫變性豆粕溶液放入超聲波器中，分別處理15，30，45，60，75，90，105，120，135min，隨后立即放入冰水浴中冷卻至室溫，在 1 500 r / min下離心 10 min，取上清液用中速濾紙過(guò)濾后，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。
1. 3. 4 高壓均質(zhì)處理
將 1. 3. 2 處理好的溶液經(jīng)過(guò)膠體磨兩次處理，準(zhǔn)備均質(zhì)處理。調(diào)整均質(zhì)機(jī)的均質(zhì)壓力為 5，10，15，20，25 MPa，樣品分別經(jīng)過(guò) 1 次和 2 次處理后，冷卻、離心等處理方式如 1. 3. 3。
1. 3. 5 微波處理
將1.3.2 處理好的溶液加入適量食用級(jí)消泡劑，放入微波爐中在輸出頻率 140，235，380，520，700 W 下加熱處理3 min，冷卻、離心等處理方式如1.3.3。
1. 3. 6 水浴加熱處理
將 1. 3. 2 處理好的溶液放入 25，40，55，70，85，100 ℃ 水浴中溫和攪拌加熱處理 120 min 后，冷卻、離心等處理方式如 1. 3. 3。
1. 3. 7 微波處理、水浴加熱處理的優(yōu)化設(shè)計(jì)
以處理時(shí)間( min) 、pH、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為影響因素，以可溶性蛋白質(zhì)含量為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了L9( 34)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)。
1. 3. 8 微波處理蛋白質(zhì)吸油性測(cè)定
樣品0.5 g 與大豆油3.5 mL 混勻，靜置30 min 后，5 000 g 離心 10 min，測(cè)定上清液中大豆油的體積。
吸油性( mL/g) = ( 起始大豆油體積－反應(yīng)后大豆油體積) /樣品質(zhì)量。
1. 3. 9 微波處理蛋白質(zhì)乳化性測(cè)定
40 mL 0. 5% 的樣品溶液，加入 14 mL 大豆油，10 000 r·min－ 1的條件下勻漿 1 min 后，立刻取 50μL，加入到 5 mL 的緩沖溶液中( 0. 1 mol /L pH 7. 0PBS) ，混勻，500 nm 下測(cè)其吸光值。
乳化性 = ( 2 ×2. 303 × A0× 稀釋倍數(shù)) /( 10 000 × ? × c) ， ( 1)
式( 1) 中，? 為 0. 25; A0為吸光值; c 為質(zhì)量濃度( g/mL) 。
1. 3. 10 微波處理后蛋白質(zhì)凝膠的制備及檢測(cè)
20% 溶液，均勻攪拌，脫氣 10 min，90 ℃ 條件下處理30 min 后，冷卻，置冰箱中過(guò)夜。通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定。
1. 3. 11 酶解高溫變性豆粕
1. 4 統(tǒng)計(jì)分析
利用 SPSS 13. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與討論
2. 1 大豆高溫豆粕成分分析
大豆高溫豆粕中水分含量接近 10% ; 蛋白質(zhì)含量高達(dá) 49%( 干基) ，基本接近干基物質(zhì)總量的一半，含量較高，但氮溶解指數(shù)( NST) 僅為 21%。眾所周知，這是大豆高溫豆粕加熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的緣故，加熱造成蛋白質(zhì)肽鏈松散，大量疏水基團(tuán)外露，從而使蛋白質(zhì) NSI 下降。
2. 2 超聲處理對(duì)高溫變性豆粕 NSI 的影響
在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%，pH 7. 0 條件下，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，豆粕溶液的 NSI 值增長(zhǎng)顯著，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到 120 min 時(shí)，溶液 NSI 值增長(zhǎng)到40. 69% ，隨后增長(zhǎng)開(kāi)始趨于平緩( 由 SPSS 的 Dun-can 式分析 120 min 和 135 min 的 NSI 值無(wú)顯著性差異) 。這可能是超聲波的瞬態(tài)空化效應(yīng)，促使能量密度高度聚集，瞬間就會(huì)產(chǎn)生高壓、高溫等一系列極端物理效應(yīng)，而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生崩潰，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性。
2. 3 高壓均質(zhì)對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)影響
隨均質(zhì)壓力的不斷提高，均質(zhì) 1 次和2 次的高溫變性豆粕溶液的 NSI 值均不斷提高，達(dá)到 20 MPa 時(shí)達(dá)到最高，分別為 50. 34% 和 50. 70%，隨后開(kāi)始下降。均質(zhì)造成的強(qiáng)剪切力是導(dǎo)致高溫變性豆粕 NSI 提高的原因，隨均質(zhì)壓力進(jìn)一步增大后，可能使已溶解的蛋白質(zhì)再次發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，疏水性基團(tuán)暴露，使得 NSI 值下降。
2. 4 加熱處理?xiàng)l件對(duì)高溫變性豆粕 NSI 的影響
溫度對(duì)高溫變性豆粕溶液的 NSI 影響十分顯著，隨著溫度的升高，NSI 值增大，當(dāng)溫度達(dá)到 100 ℃時(shí)，溶液的 NSI 值到達(dá)最高的 66. 56%。這與傳統(tǒng)理論認(rèn)為蛋白質(zhì)在受熱情況下變性，溶解性下降所不同。但本研究的結(jié)果與一些研究者的結(jié)論是一致的，Arrese 等對(duì)大豆分離蛋白的 7S 和11S 蛋白質(zhì)進(jìn)行了 DSC 測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 7S 和 11S 蛋白質(zhì)的變性溫度分別是74 ℃和83 ℃。 Arrese 等、Petruccelli 等和 Wagner 等對(duì)加熱大豆分離蛋白的 NSI 進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn) 100 ℃下大豆分離蛋白仍然具有較高的溶解性。高溫加熱處理，大豆分離蛋白 NSI 的提高是由于 7S 和 11S 之間的亞基通過(guò)二硫鍵重新結(jié)合，疏水性基團(tuán)被包裹在中間，形成可溶性聚合物，因此加熱可以提高高溫變性豆粕溶液 NSI 值。
2. 5 微波處理對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)影響
在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2%，pH 7. 0，微波輸出功率對(duì)高溫變性豆粕溶液的NSI 值影響比較顯著，在 520 W、700 W 條件下溶液NSI 值明顯高于其他輸出功率下的 NSI 值，分別為49. 15% 和 51. 45% ，輸出功率在 700 W 條件下 NSI值與 520 W 相比較有顯著性差異。由于微波輸出功率的不同造成水分子每秒鐘的震蕩次數(shù)不同，輸出功率升高，水分子震蕩更加激烈，使得溶液溫度不斷提高，水分子與豆粕的蛋白分子相互碰撞次數(shù)升高，從而使蛋白分子的結(jié)構(gòu)造成的一定的變化，使其N(xiāo)SI 值升高。
2. 6 加熱處理?xiàng)l件對(duì)高溫變性豆粕的影響
2. 6. 1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)高溫變性豆粕 NSI 的影響
在 100 ℃沸水浴條件下，隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)從 1% ～2%，高溫變性豆粕溶液的NSI 值基本沒(méi)有變化 ( 僅從 68. 81% 緩慢下降到68. 53% ) ，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增高，NSI 值急劇下降。這可能由于沸水浴向底物傳遞的熱量是一定的，當(dāng)溶液濃度過(guò)大時(shí)，加熱所提供的熱量不足以使高溫變性豆粕全部的 7S 和 11S 蛋白質(zhì)之間的亞基重新結(jié)合，形成可溶性聚集物，因此當(dāng)?shù)孜餄舛仍龈�，相�?duì)于全部蛋白質(zhì)的可溶性蛋白質(zhì)，由于沒(méi)有形成足夠的可溶性聚合物，造成其 NSI 值下降。
2. 6. 2 時(shí)間對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)的影響
隨著時(shí)間增加，高溫變性豆粕溶液的 NSI 值逐漸增高。統(tǒng)計(jì)分析表明: 時(shí)間達(dá)到60 min 時(shí)溶液 NSI 值為 67. 21% ，與更長(zhǎng)時(shí)間的 NSI值無(wú)顯著性差異( 由 SPSS 的 Duncan 式分析 60 min后的 NSI 值無(wú)顯著性差異) ，因此認(rèn)為從 60 min 后溶液 NSI 值趨于平緩。
2. 6. 3 pH 值對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)的影響
pH 值對(duì)熱處理高溫變性豆粕溶液的 NSI 值影響的趨勢(shì)明顯，隨溶液 pH 升高，溶液的 NSI 值不斷增加，當(dāng) pH 7. 0 時(shí)達(dá)到62. 63%，之后趨于平緩，這是由于在較高 pH 值下，被質(zhì)子化的酸性及堿性氨基酸殘基基團(tuán)失去了質(zhì)子，使得蛋白質(zhì)帶負(fù)電; 另外，pH 值會(huì)改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，不同結(jié)構(gòu)下的氨基酸殘基不同，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性的改變。
2. 6. 4 加熱處理高溫變性豆粕的條件優(yōu)化
依據(jù)加熱處理高溫變性豆粕的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)提高 NSI 顯著的因素和水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。極差分析發(fā)現(xiàn)，pH 值對(duì)高溫變性豆粕溶液的NSI 值影響最為顯著，其次為加熱時(shí)間和底物濃度。
優(yōu)化方案為: A3B3C1，即 pH 8. 0，時(shí)間 90 min，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在此條件下高溫變性豆粕溶液的NSI 值高達(dá)為 74. 81% 。
2. 7 不同微波處理?xiàng)l件對(duì)高溫變性豆粕 NSI 影響
2. 7. 1 微波處理時(shí)間對(duì)高溫變性豆粕 NSI 的影響
隨微波加熱處理時(shí)間的增長(zhǎng)，高溫變性豆粕溶液的 NSI 值不斷增長(zhǎng)，到達(dá) 4 min時(shí)為 69. 1%，隨后開(kāi)始趨于平緩。
2. 7. 2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)的影響
隨底物濃度增加，高溫變性豆粕溶液 NSI 值不斷升高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 4%時(shí)，NSI 值達(dá)到 70. 83% 為最高，隨即開(kāi)始下降。這與加熱處理有所不同，由于微波加熱的分子運(yùn)動(dòng)的高能量，使得溶液加熱更充分，但底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，可能使高溫變性豆粕蛋白受熱不充分，從而導(dǎo)致溶液 NSI 值下降。
2. 7. 3 pH 值對(duì)高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)的影響
隨溶液 pH 值升高，高溫變性豆粕溶液 NSI 值先升高，pH 值達(dá)到 7. 0 時(shí) NSI值為 71. 49 %，隨后趨于平緩。這與加熱處理的 pH值影響趨勢(shì)基本相同。
2. 7. 4 微波加熱處理高溫變性豆粕的條件優(yōu)化
根據(jù)微波處理高溫變性豆粕的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì) NSI 影響顯著的因素和水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。極差分析發(fā)現(xiàn)，以因素 pH 值對(duì)高溫變性豆粕溶液的 NSI 值影響最為顯著，然后依次為時(shí)間和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，優(yōu)化方案為: A3B3C1，即 pH 8. 0，時(shí)間5min，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3% 。
通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，在此條件下高溫變性豆粕溶液的 NSI 值高達(dá) 70. 39%。
2. 8 吸油性的研究
大豆分離蛋白( SPI) 、未處理高溫變性豆粕( control) 、微波改性后的高溫變性豆粕( MWIT) 、酶解改性后的高溫變性豆粕( EMT) 吸油性差異比較結(jié)果比較。MWIT、EMT 以及 SPI、對(duì)照樣品吸油性差異性顯著。與對(duì)照樣品相比，SPI的吸油性最高，MWIT 其次，EMT 最低。形成這種結(jié)果的原因可能是微波改性改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使原本變性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了重排，趨向于恢復(fù) SPI的功能性，使疏水集團(tuán)大量暴露，提高吸油性。酶改性蛋白質(zhì)分子量下降，親水基團(tuán)數(shù)量上升而疏水基團(tuán)數(shù)量下降，導(dǎo)致其親油性下降。
2. 9 pH 值對(duì)樣品乳化性的影響
隨 pH 值的升高，樣品的乳化性整體呈上升趨勢(shì); 但在 pH 值為 4. 0 時(shí)，4 種樣品的乳化性均最低。
SPI、control、MWIT 以及 EMT 的乳化性分別從 1. 58，1. 42，2. 87，1. 20 mL / g 上升到 26. 41，17. 29，27. 83，8. 47 mL / g。由此可知，微波改性明顯提高了高溫變性豆粕的乳化性，顯著高于酶改性樣品。這可能是微波處理后的蛋白質(zhì)形成了聚合物，親水性氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基分布均勻，當(dāng)遇到水和油時(shí)能夠更好地將親水基和疏水基在兩相界面展開(kāi)，pH 值升高有利于聚合物在油和水界面的分布，并形成均一穩(wěn)定的乳化液。而酶改性蛋白質(zhì)由于酶解過(guò)程，蛋白質(zhì)分子量變小，大量疏水性氨基酸被酶解，在兩相界面不能形象良好的伸展，致使其親油性下降。而酶改性使得蛋白質(zhì)分子質(zhì)量親水性氨基酸殘基大量暴露而疏水性氨基酸殘基被大量破壞，使得乳化性明顯下降。
2. 10 樣品凝膠性的研究
SPI 和 MWIT 形成了較為結(jié)實(shí)的凝膠，凝膠強(qiáng)度超過(guò)了 300 g，而且 MWIT 形成的凝膠強(qiáng)度和黏度都比 SPI 大; 樣品 control 和 EMT 未檢測(cè)到凝膠的形成，這可能是 control 樣品在加熱中的熱變性破壞了其三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，從而喪失了形成凝膠的能力。由于微波處理形成的聚合物，以二硫鍵為主形成更為穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于水分的保持，產(chǎn)生更大的凝膠強(qiáng)度。
2. 11 加熱處理和微波處理對(duì)高溫變性豆粕 NSI影響的比較
微波處理靠電子輻射，造成分子震動(dòng)，并使溶液溫度升高; 加熱處理靠熱傳遞對(duì)溶液升溫。這兩種方式都是由于加熱使大豆球蛋白的 AB 亞基斷裂，與 β-半球蛋白的亞基發(fā)生結(jié)合，形成新的可溶性聚合物，使高溫變性豆粕的 NSI 值升高。在相同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)( 3%) 下，微波處理后 NSI 值達(dá)到 70. 39%，但加熱處理后 NSI 值僅為 63. 96%。從得到的結(jié)果分析，加熱處理和微波處理對(duì)提高高溫變性豆粕的 NSI 值都十分有效，尤其是微波處理的底物濃度更高，處理的時(shí)間更少，處理的效果更顯著，因此，微波處理技術(shù)應(yīng)用在高溫變性豆粕溶解性改性方面具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
微波處理后的 NSI 值低于本課題組酶解處理后的 NSI 值，但微波改性后蛋白質(zhì)的吸油性、乳化性和凝膠性均優(yōu)于酶解處理后的。這是由于蛋白質(zhì)具備高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)才具備蛋白質(zhì)的功能特性，微波處理使得蛋白質(zhì)形成了可溶性聚合物，分子質(zhì)量提高，而酶解使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量減小，肽鏈斷裂，疏水性氨基酸殘基數(shù)量減少，更多的親水性氨基酸殘基暴露，溶解性上升，但蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，功能性下降。
來(lái)源：惠合膠體磨設(shè)備廠

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